植物防卫素/植物抗毒素(PDF)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒 植物防卫素/植物抗毒素(PDF)ELISA试剂盒 仅供体外研究使用
预期应用
ELISA法定量测定植物组织、细胞或其它相关样本中防卫素/植物抗毒素(PDF)含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗PDF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗PDF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的PDF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板：一块(96孔)
1. 标准品(冻干品)：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20 ng/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)，分别稀释成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制10 ng/ml标准品：取0.5ml(不要少于0.5ml)20 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
2. 样品稀释液：1×20ml/瓶。
3. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。
4. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。
5. 检测溶液A：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
6. 检测溶液B：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
7. 底物溶液：1×10ml/瓶。
8. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
9. 终止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
10. 覆膜：1×5张
操作步骤
实验开始前，请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。
注：
1. 每次实验留一孔作为空白调零孔(不同于空白孔)，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。
3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，洗板拍干后请立即加入后步试剂，应避免微孔干燥掉。
4. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
5. 在储存和温育时避免强光直接照射。
6. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
7. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水
纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需
要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的植物防卫素/植物抗毒素(PDF)，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线(推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3)，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6. 底物请避光保存。
说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。
3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。
4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
8. 有效期：6个月
